PCR实验室设计基本原则

PCR是众所周知的分子生物学技术之一。20世纪70年代，研究人员首次报道了使用合成引物和DNA聚合酶从模板复制单链DNA。直到1983年，Kary Mullis才发明出用于扩增目标DNA的研究工具，就是我们今天所熟知的PCR方法。从此以后，PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分，在基础研究、常见疾病诊断、法医调查、农业检测等广泛领域中具有相当高的实际应用价值，新冠病毒的检测也是用的此法，扩增出病毒的基因片段从而判断是否感染病毒。

PCR实验室是PCR扩增技术实际应用的场所，该实验室设计的一般原则是按照实验步骤总体分为试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区三个各自独立的实验区域。

（1）试剂准备区

在试剂准备区域内进行试剂的制备、分装以及主反应混合液的制备。试剂盒作为制作样品的原材料就直接被运送至该区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的试剂。

相关设备有超净工作台、实验桌、药品冷藏箱、柜子、低温冰箱、紫外消毒车、与标本制备区连通的传递窗和椅子、垃圾桶，实验桌上放置实验仪器设备（包括离心机、震荡器、金属浴（电热恒温培养箱、水浴锅）、移液器、离心管、废液缸）。

（2）标本制备区

在标本制备区主要进行样品的保存、核酸提取、贮存及其加入扩增反应管和测定DNA的合成。

相关设备有实验桌、低温冰箱、生物安全柜、紫外消毒车、水槽和椅子，离心机、电热恒温金属浴、旋涡混合器、移液器、离心管、废液缸和垃圾筒等）、核酸提取仪。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染，一般为+10Pa.

（3）PCR扩增区

在PCR扩增区内主要进行DNA的扩增。此外，已制备的DNA模板(来自样品制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂准备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。

相关设备有紫外消毒车、实验桌、柜子、定量PCR扩增仪、电脑、打印机、废液缸和垃圾筒等、离心机、移液器。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压，一般为-25Pa，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

整个区域结构排布：三间独立的试验区依次为试剂准备区、标本制备区及PCR扩增区，并不相互直接连通，若紧密连接，应当安装物品传递窗。在缓冲区外是一条整体性的连通的专用缓冲走廊来连接三个独立的区域。

每个独立的实验区都配有相应的缓冲区，工作区与缓冲间应安装连锁装置。缓冲区通过调节气压，避免在PCR实验操作进行中标本和试剂遭受气溶胶扩散的污染，同时也避免扩增产物对环境和实验人员造成污染。打开实验缓冲区和PCR扩增区的排风扇，就会向外排出气体，而实验区的外墙和各扇门上都设置有回风口，风量可以调节，这样就能实现往室内换气的目标。

标准PCR实验室的注意事项：

①各个工作区标志需要明确落实，避免不同实验区域内设备或材料物品交叉滥用，导致污染；

②在不同的区域内工作，实验人员需着各自对应的实验工作服，在离开工作区域时，便不得将工作服带出工作区域；

③进入各个工作区域内必须保证单一方向操作，即试剂准备区→标本制备区→PCR扩增区，不得逆向流动；

④灯具方面：需选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的目的。在三个试验工作区和三个缓冲区顶部及传送窗内部都装有紫外灯，以便消毒。在试剂预备区和标本制备区还装置移动紫外线灯，对试验桌进行部分消毒。紫外灯波长为254mm，每20m一支40W的紫外灯。

⑤气流方面：为防止环境对扩增产物的影响，各实验区的气流方向设置为：空气由试剂准备区流向缓冲区，标本制备区流向缓冲区，缓冲区流向PCR扩增区；
工作时，应使缓冲区和PCR扩增区为负压，其它各室为“0”压或“+”压。各区域之间应具备单间的实验工艺流，物流，人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验室之间的相互干扰，防止气溶胶扩散对实验过程造成污染。PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式，严格控制送风排风的比例，以保证个实验区的压力适宜。

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